郭楠李宝萍李慧萍杨琦姚兴伟杨曦明
选自中华检验医学杂志,,39(11)
甲状腺结节(thyroidnodule，TN)是一种常见疾病，发病率高。一般人群触诊发现的患病率为3%～7%，高清晰超声检查发现的患病率达20%～76%[1]。甲状腺结节多为良性，恶性结节占5%～15%，因此早发现、早诊断、早治疗是十分重要的。近些年来，有研究报道miRNA表达失调在甲状腺疾病中具有重要作用，为临床上甲状腺疾病的诊断提供一个新的方向[2]。另外，也有学者发现在组织中异常表达的miRNA在血浆等体液中也能检测到其异常的表达，这些在血浆中的miRNAs在细胞间传递信息。因此，研究血浆中循环miRNA可为疾病的发病机制和患者临床特征提供重要的信息。本研究拟采用TaqmanmiRNA芯片技术，对甲状腺结节组织与正常甲状腺组织的miRNAs的差异表达谱进行分析，并与血浆中miRNAs进行比较，为进一步筛选血浆中具有诊断或预后评估意义的miRNA提供了实验依据。
对象与方法
一、材料
1．研究对象：
选择年5至7月在北京医院进行甲状腺结节手术女性患者5例，平均年龄为(53.23±8.27)岁，取其甲状腺结节组织作为实验组，结节旁组织作为对照组，进行miRNAs表达谱检测以筛选异常表达的miRNA。血浆miRNA表达验证实验：选择同期来院体检的女性，B超诊断为甲状腺结节的患者16例，平均年龄为(51.63±13.04)岁，作为实验组；B超检测无甲状腺结节的正常健康女性15名，平均年龄(49.77±9.43)岁，作为对照组，分别收集其血浆。所有患者均无其他肿瘤疾病。本研究经北京医院伦理委员会批准(北京医院医学伦理审批件：ECPJ－BDY－－92)进行。
2．样本收集：
用于芯片检测的组织样本，取自5例甲状腺结节手术女性患者。术后快速取新鲜甲状腺结节及结节旁组织50～mg，离体30min内放置于液氮罐中冻存，然后转入－80℃冰箱保存。所有组织标本均经术中快速冰冻及术后常规病理检查一致确认为良性甲状腺结节。用于临床验证的血浆样本，来自16例B超诊断为甲状腺结节的女性患者以及15名正常健康女性，分别采集静脉血2ml，用乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid，EDTA)抗凝，r/min(×g)离心10min分离血浆，－80℃冰箱保存备用。
二、方法
1．RNA提取：
取5例甲状腺结节手术女性患者甲状腺结节及结节旁组织30～50mg，及16例B超诊断为甲状腺结节的女性患者及15名健康对照女性血浆μl，根据TRIzolLS试剂盒(美国Invitrogen公司)说明书步骤提取。将所得RNA置于－80°C冰箱中保存备用。
2．miRNAarray：
将组织提取RNA混匀，取10ng进行反转录[TaqManmicroRNA反转录试剂盒，MegaplexRTprimersHumanPoolA,(美国AppliedBiosystems公司)]。对上述获得的miRNA的cDNA进行预扩增[MegaplexPreAmpprimerHumamPoolA,PreAmpMasterMix(美国AppliedBiosystems公司)]。将预扩增的产物与TaqMangeneexpressionMasterMix混合，加入到TaqManHumanMicroRNAArrayA(美国AppliedBiosystems公司)，采用ABIPRISMHT实时荧光定量PCR仪进行扩增。U6作为内参照，采用2－ΔΔCT法计算实验组和对照组miRNA的相对表达量。其中ΔCT为CT靶基因与CT内参基因(U6)的差值，2－ΔΔCT表示实验组与对照组基因表达的差异倍数。
3．血浆miRNAs定量检测：
定量检测使用美国ABI公司的microRNA实时荧光定量检测试剂盒，操作步骤按照厂家说明进行。表达差异的比较方法同上。
4．统计学分析：
所有数据采用SPSS13.0软件进行处理。两组比较采用独立的t检验；相关分析采用Pearson相关分析法。以P0.05为差异有统计学意义。
结果
一、甲状腺组织miRNAqRT－PCRarray结果
对5例甲状腺结节手术女性患者的甲状腺结节及其周围正常组织进行了种人miRNA分子的初步定量鉴定。57个miRNA得到了差异扩增(t＝3.,3.,4.,3.,－5.,4.,－4.,3.,5.,－2.,2.,4.,4.,－2.,－3.,－4.,3.,3.,4.,3.,2.,－3.,3.,2.,5.,3.,－4.,3.,3.,4.,4.,4.,－3.,5.,－3.,－3.,－4.,－2.,4.,2.,4.,2.,3.,－4.,4.,3.,3.,－5.,4.,－3.,－5.,4.,－4.,5.,2.,－3.,－4.,P0.05)，其中34个miRNA表达上调，23个miRNA表达下调，见表1。
表1
甲状腺结节组织中差异表达的miRNAs
在57个表达异常的miRNA中，表达上调1.5倍的miRNA有13个，分别是miR－30d，miR－，miR－a，miR－b，miR－－5p，miR－，miR－29b，miR－，miR－a*，miR－a,miR－20a，miR－10a和miR－a－5p；表达下调0.6的miRNA有2个：miR－a－5p和miR－31。
二、血浆中表达差异miRNAs验证
针对上述组织中显著差异的15条miRNA(表达上调1.5倍及表达下调0.6倍)，分别测定其在B超检查无甲状腺结节的15名健康女性与B超诊断为甲状腺结节的16例女性患者的血浆中表达水平。其中miR－b(t＝2.，P＝0.),miR－(t＝2.，P＝0.),miR－a*(t＝2.，P＝0.)和miR－31(t＝2.，P＝0.)在甲状腺结节患者血浆中表达较无甲状腺结节正常对照组高，其差异有统计学意义；miR－a(t＝－3.，P＝0.),miR－－5p(t＝－2.，P＝0.01),miR－a(t＝－2.，P＝0.),miR－(t＝－2.，P＝0.)比无甲状腺结节正常对照组表达量低，其差异有统计学意义；miR－30d,miR－,miR－29b,miR－20a,miR－a－5p,miR－10a及miR－a－5p表达水平与无甲状腺结节正常对照组的差异无统计学意义(表2)。
表2
甲状腺结节组(n＝16)与正常对照组(n＝15)血浆中miRNAs的表达水平
甲状腺结节患者血浆中miRNA的表达与组织中的表达水平不尽相同。与组织中表达差异的miRNA具有一致趋势，且表达水平较正常对照组血浆高于1.5倍的miRNA有miR－b，miR－及miR－a*,相对表达水平分别是1.59倍，7.74倍和11.62倍。经Pearson相关性分析，miR－b,miR－及miR－a*在组织及血浆中的表达有相关性，r值分别为0.，0.和0.,差异有统计学意义(表3)。
表3
miRNAs在甲状腺结节组织与血浆中表达的相关性分析
讨论
甲状腺结节是一种临床常见病，发病机制与病因目前仍不明了，可能与遗传、放射、免疫、化学物质刺激及内分泌变化等多方面综合刺激有关。流行病学研究发现，我国自6年实行食盐加碘法规以来，居民处于碘过剩状态，甲状腺结节患病率明显增加[3]。普通人群触诊断的甲状腺结节患病率为3%～7%，高分辨率B超检查诊断的甲状腺结节的患病率为20%～76%。虽然男性的甲状腺体积大于女性，但是女性甲状腺肿和甲状腺结节的患病率显著高于男性[4,5,6]。有些甲状腺结节，由于上皮细胞的过度增生，可以形成胚胎性腺瘤或乳头状腺瘤，也可形成甲状腺癌。甲状腺结节中甲状腺癌的患病率为5%～15%[7]，并且近年来我国甲状腺癌的发病率呈现明显上升趋势。
目前，甲状腺细针穿刺活检术(fineneedleaspirationbiopsy，FNAB)被认为是鉴别良恶性结节的金标准[8]。研究表明，行FNAB后经细胞病理学检查，其中5%为恶性，60%～70%为良性，10%～30%不确定或可疑恶性，对这些不确定或可疑恶性病例进行术后病理检查，发现仅20%～25%为甲状腺癌，故有70%～85%的患者接受了不必要的手术[9]。因此，如何正确处理FNAB无法鉴别的病例，正确评估甲状腺结节有助于鉴别诊断甲状腺结节的性质，尤其是良恶性的鉴别，从而为患者提供最佳的个体化治疗方案，是目前临床医师面临的困难。随着分子生物学技术的发展，应用分子标志物对甲状腺癌进行鉴别诊断，能显著提高早期诊断水平，对甲状腺癌的早期诊断、治疗及预后分析有重要的临床意义。
microRNA(miRNA)是一类大小为17～25bp的非编码小RNA，进化上高度保守，通过转录后调控的方式对其靶基因表达水平进行调节，参与疾病发生的各个环节，包括细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡等。近来，有学者发现在组织和血浆中的miRNA表达具有相关性，有些组织中异常表达的miRNA引起血浆中miRNA水平的变化。血浆中的miRNA来源可能有下面几种：细胞直接分泌到血浆中；细胞选择性地将miRNA包装到微小颗粒或外泌体后分泌出去；miRNA也可能是通过包裹在凋亡小体里随着细胞裂解进入血浆中；还有一些miRNA是通过与AGO蛋白或者高密度脂蛋白结合的形式进入血浆。越来越多的研究表明血液或其他体液中的miRNAs水平与肿瘤的预后、疗效、生存期等显著相关[10,11,12,13]。研究血浆中循环miRNA可为疾病的发病机制和患者临床特征提供重要的信息。况且血浆中miRNA比较稳定，也容易获得，容易操作，因此血浆中的miRNA作为生物标志物具有非常好的应用前景。
近年来有比较多的甲状腺疾病相关的miRNA表达差异谱的研究工作，比如针对自身免疫性甲状腺病[14,15]，甲状腺癌[16,17,18]等。现有的关于甲状腺miRNA的研究更多白癜风的医疗医院北京中科医院是骗子
